生物标志物定量分析 | 同时检测人血浆中15种胆汁酸的生物分析方法
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发布日期:2022-03-01
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导读
在20世纪20年代初,德国生物化学家HeinrichOttoWieland通过研究确定出胆汁酸的化学组成,他的研究结果帮助阐明了胆汁酸在肠内各种物质吸收过程中的作用,因此获得了1927年诺贝尔化学奖[1]。
胆汁酸(Bileacids,简称BA),为胆汁的主要有机成分,是一类二十四碳胆烷酸羟基衍生物的总称。胆汁酸是由肝脏代谢胆固醇产生,经胆囊浓缩后排入到肠道内;在肠道上段胆汁酸发挥其生理功能,促进脂类物质的消化和吸收,在肠道下段(即回肠及近侧结肠),胆汁酸在肠内细菌作用下发生转化,形成结合型胆汁酸;在肠黏膜中,95%的胆汁酸以原型或转化的形式,按主动运输或被动运输的方式被重新吸收,被重吸收的胆汁酸通过门静脉血回到肝脏中[2],这种胆汁酸在肠道和肝脏之间的转运被称为胆汁酸的肝肠循环。肝脏、胆囊和肠道的疾病会影响胆汁酸的代谢和转运,导致体内胆汁酸水平的变化。
不同的胆汁酸亚型在临床上具有不同诊断意义,因此检测每一种亚型的胆汁酸在体内的水平,而非简单地定量测定总胆汁酸水平,对于肝胆和肠道疾病的筛查,诊断和鉴别诊断具有重要作用,成为一系列疾病临床诊断中的重要生物标志物[3]。
图1.(A)人胆汁中主要胆汁酸的合成以及在肝脏,胆道和消化系统中的循环路径;(B)结合型胆汁酸的结构;(C)胆汁酸有疏水基团和极性基团,具有两性
(图片来源:参考资料[2])
胆汁酸结构和分类
胆汁酸是一系列24碳胆烷酸的羟基衍生物,不同的亚型主要体现在甾核上羟基的数量,位置和结构的不同,如图2所示。
Compound Name | R1 | R2 | R3 |
CA (Cholic acid) | -OH | -OH | -OH |
CDCA (Chenodeoxycholic acid) | -OH(α) | -OH(α) | -H |
DCA (Deoxycholic acid) | -OH | -H | -OH |
UDCA (Ursodeoxycholic acid) | -OH(α) | -OH(β) | -H |
LCA (Lithochoic acid) | -OH | -H | -H |
图2.胆汁酸的化学结构
按结构胆汁酸可分为两大类,一类是游离型胆汁酸(freebile acids),包括胆酸(cholicacid, CA),去氧胆酸(deoxycholicacid, DCA),鹅去氧胆酸(chenodeoxycholicacid, CDCA),熊去氧胆酸(ursodeoxycholicacid, UDCA)和石胆酸(lithocholicacid,LCA)。另一类是结合型胆汁酸(conjugatedbile acids),为上述游离型胆汁酸与甘氨酸和牛磺酸的结合物,有甘氨胆酸(glycocholicacid,GCA),牛磺胆酸(taurocholicacids,TCA),甘氨鹅去氧胆酸(glycochenodeoxycholicacid,GCDCA),牛磺鹅去氧胆酸(taurochenodeoxycholicacid,TCDCA),甘氨去氧胆酸(Glycodeoxychoicacid,GDCA),牛磺去氧胆酸(Taurinedeoxycholicacid, TDCA),甘氨熊去氧胆酸(Glycoursodeoxycholicacid, GUDCA),牛磺熊去氧胆酸(Tauroursodeoxycholicacid,TUDCA),甘氨石胆酸(Glycolithocholicacid, GLCA),牛磺石胆酸(Taurolithocholicacid,TLCA),如图2所示。
按来源胆汁酸可以分为两大类,初级胆汁酸(primarybileacids),由肝细胞直接合成的,包括胆酸、鹅脱氧胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸。次级胆汁酸(secondarybileacids),并非肝细胞最初产生的胆汁酸,而是经历了肠道细菌的分解,以及肠肝循环后形成的产物,故冠名为“次级”,有去氧胆酸,石胆酸,熊去氧胆酸,甘氨去氧胆酸,牛磺去氧胆酸,甘氨熊去氧胆酸,牛磺熊去氧胆酸,甘氨石胆酸,牛磺石胆酸等。
备注:*胆酸和去氧胆酸的甘氨酸和牛磺酸的结合物是初级胆汁酸
图3.胆汁酸的分类
胆汁酸的检测难点
临床检测实验室胆汁酸测量大多数采用非色谱法,提供总胆汁酸的浓度信息,但这些方法不能提供各个亚型胆汁酸的浓度。液相色谱-串联质谱技术(LC-MS/MS),结合了液相的分离能力和质谱的特异性和高灵敏度的特性,非常适合各个亚型胆汁酸的同时定量分析。
用LC-MS/MS同时检测15种不同极性的胆汁酸,方法存在很大的挑战。由于胆汁酸存在种类多,结构复杂,同分异构体较多(如表1所示),极性差异大的特点,使得胆汁酸的分离分析十分困难;胆汁酸甾核部分结构刚性,某些游离型胆汁酸不容易形成稳定的碎片离子,要检测出基质中低水平的胆汁酸浓度,需要对质谱参数进行仔细的优化。胆汁酸为血浆基质中的内源性化合物,要对其进行准确定量,选用合适的空白基质制备标准曲线就显得尤为重要。因此,建立稳定性的,能同时检测人血浆基质中15种胆汁酸的LC-MS/MS方法需要克服以上方方面面的问题。
表1.同时检测15种胆汁酸的生物分析方法信息列表
解决方案
药明康德测试事业部生物分析部LC-MS平台,建立了一种快速灵敏的液相色谱-串联质谱方法。采用电喷雾负离子模式,简单且能自动化操作的样品前处理方法,利用反相色谱条件,在10分钟之内同时定量分析检测人血浆中15种胆汁酸的浓度。该方法稳定、检出限低、分离度好,能够满足临床试验中生物标志物的检测需求。药明康德测试事业部生物分析部与全球制药企业及医院有广泛的合作,生物标志物的方法开发,验证和样品检测为常规的服务项目。多年以来,我们积累了丰富的经验,对于同时检测多个生物标志物的项目也有相应的策略。表1为血浆中15种胆汁酸方法的分析物,定量下限信息。图4为人血浆中15种胆汁酸在液相上的分离和保留情况。
图4.血浆中15种胆汁酸的液相色谱图
结语
参考文献:
[1].https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/1927/wieland/facts/
[2].Verónica Urdaneta, et al., Interactions between Bacteria and Bile Salts in the Gastrointestinal and Hepatobiliary Tracts, frontiers in Medicine, 2017, doi: 10.3389/fmed.2017.00163
[3].尹凯哥,冯志杰,胆汁酸的代谢、生理作用及其临床意义[J]. 世界华人消化杂质,2012, 20(35); 3542-3548.
[4].Siamak MahmoudianDehkordi, et al., Altered bile acid profile associates with cognitive impairment in Alzheimer's disease-An emerging role for gut microbiome, Alzheimers Dement. 2019 Jan; 15(1):76-92, doi: 10.1016/j.jalz.2018.07.217.
-药明康德测试事业部-
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