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寡核苷酸分析策略

1.1

寡核苷酸的定义及分类

寡核苷酸是一类靶向mRNA的短的RNA或DNA序列及其类似物，根据致病基因的碱基序列进行设计，通过影响mRNA的转录，实现对致病蛋白表达下调或者恢复蛋白表达，从而起到治疗疾病的作用。

寡核苷酸药物主要有以下几种类型：ASO（反义寡核苷酸）、siRNA（小干扰RNA）、miRNA（微小RNA）、Aptamer（核酸适配体）。

目前已经获批上市的15款寡核苷酸药物中，大部分为ASO，仅一款Aptamer，四款siRNA（其中三款使用GalNAc修饰）。而在PK/TK分析手段的选择上，约一半药物选择的是基于液相色谱的分析平台，对于定量下限的需求一般在1-10ng/mL。那么在寡核苷酸类药物的研发过程中，生物分析扮演了怎样的角色？又该如何选择分析平台呢？

1.2

寡核苷酸生物分析

寡核苷酸药物研发生物分析部分需要解答四类问题，包括：药物及其代谢物分析，免疫原性分析，免疫毒性评价，药效检测（图1）。药明康德全球生物分析团队建立的完整的生物分析平台可应用于这些问题的解答。在药代毒代这个环节，已建立四大检测平台：LC-FLD（液相荧光平台）、LC-MS/MS（液质联用平台）、Hybrid ELISA（杂交酶联免疫平台）、、PCR（聚合酶链式反应），可根据寡核苷酸的类型和大小、灵敏度和特异性需求、以及分析通量来选择分析平台（图2）^[1]。

图1. 寡核苷酸药物研发的四大检测范围及分析平台

图2. 分析平台灵敏度与寡核苷酸大小的关系

对于寡核苷酸药物，在各种生物基质中药物浓度的测量、代谢物的鉴定和定量是关键的初始步骤，可以为PK和TK的评估以及代谢途径的阐明提供必要的信息。而大量内源性的相似DNA和RNA的存在，以及寡核苷酸和其代谢物的相似性，给生物分析方法的建立带来了很大挑战^[2]。对于寡核苷酸及其代谢物的分析，更需要一个稳健的、选择性高的、灵敏度高的生物分析方法。

寡核苷酸的PK和TK评估，目前主流的分析方法是LC-MS/MS，LC-FLD作为补充，因为其他方法（LC-FLD, Hybrid ELISA, qPCR）多是利用碱基互补配对原则，探针一般为比待测序列短或长的寡核苷酸链，不能很好的区别母药和丢失GalNAc的代谢物。以目前研究热门的GalNAc-siRNA为例，这一类药物代谢物丰富，所以往往需要排除代谢物在检测过程中对母药的影响，由于部分代谢物的量超过母药的10%，且具有一定的药物活性，还需要根据实际情况进行评估代谢物浓度。本期主要介绍LC-MS/MS平台和LC-FLD平台的寡核苷酸生物分析策略。

LC-MS/MS平台可以很好的实现寡核苷酸在血浆和组织中的药物浓度分析，寡核苷酸药物由于其骨架上的磷酸酯结构，决定了其易于形成多电荷的负离子，在ESI源负离子模式下响应较好，同时也因为容易结合金属离子，从而分散质谱信号。经过前处理的样本会在液相上面实现分离，将待测物和杂质分离开来，然后进入质谱中离子化，按照离子的质荷比再次筛选。因此LC-MS/MS在寡核苷酸药物的代谢物定量分析上较其他平台拥有很大的优势。除了选择性，还有多通道检测，同时检测反义链（AS）, 正义链（SS）和代谢产物也是LC-MS/MS的一大优势。

2.1

样品前处理方式选择

对血浆和组织样本进行前处理时，液液萃取和固相萃取两种方式比较常见，液液萃取常见溶剂为苯酚、氯仿，成本低，操作简便，但不是每种寡核苷酸都能提取出来，另外它处理后的样本中杂质含量较多。固相萃取是通过离子交换的方式将待测物和杂质分离洗脱出来，成本高，操作复杂，但处理出来的样本比较干净，对色谱柱更友好，还可对样本进行浓缩，提高灵敏度（图3）。

图3. 固液萃取原理

2.2

流动相该如何选择

寡核苷酸的结构决定了它极性非常强，在常规的反向色谱柱上很难保留，可以使用HILIC模式或者借助于离子对试剂在反相柱上实现保留，烷基胺这类分子有一个疏水的尾巴和带正电的头，疏水尾巴和色谱柱结合，带正电的头和寡核苷酸通过静电作用结合实现保留。因此烷基胺常常作为离子对试剂添加到流动相中实现保留。六氟异丙醇是个弱酸，可以调节流动相的pH，改善峰形和保留，常和烷基胺搭配使用，但在质谱离子化过程中会引起离子抑制，因此使用时要综合考虑方法的色谱表现和灵敏度。

荧光的检测原理就是将RNA两条链解旋，其中待测链和带荧光基团的PNA（肽核酸）探针结合，PNA是一类以多肽骨架取代磷酸主链的DNA类似物，由于PNA不带负电荷，与DNA和RNA之间不存在静电斥力，因而结合的稳定性和特异性都大为提高（图4）。基于碱基互补配对原则的荧光检测方法不如质谱法选择性高，但荧光检测的优势在于其灵敏度可比质谱高10倍。由于需要通过液相分离来实现其选择性，将干扰或代谢物分离开来，因此，荧光分析方法往往比质谱方法需要更长的分析时间。

图4. 荧光检测的原理

对于药明康德全球生物分析团队的寡核苷酸药物四大检测平台，在平台特异性、灵敏度、通量等方面各有优势（表1）。LC-MS/MS平台除了可以通过色谱分离区分代谢物和干扰物，还可通过分子量区分代谢物和原药形式，具有更高的特异性和选择性。基于碱基互补荧光探针杂交的高效液相色谱分析具有较高的灵敏度，也可实现代谢物的分离和定量分析，但需要较长的分析时间。qPCR方法和ELISA的分析也是依赖于分析物与互补链的杂交，需要选择、设计和合成试剂，因此方法的稳健性会依赖于试剂的设计和可用性。虽然这两个平台不能很好的区分完整的寡核苷酸链和它的代谢物^[3]，但在灵敏度上具有显著的优势，可根据分析需求进行选择。

药明康德生物分析部拥有丰富的寡核苷酸生物分析经验，已开发并验证符合GLP法规（NMPA、FDA、OECD）的多种生物分析方法，涵盖ASO、PPMO、siRNA等多种药物类型。此外药明康德生物分析部还拥有全自动化的样本前处理系统，使得样本处理标准化，保证样本分析的高通量和高质量。我们可以根据客户需求，结合项目特点，推荐合适的分析平台，为客户提供全方位的药物研发生物分析解决方案。

未完待续，敬请期待下一篇，我们将分享hybrid ELISA与qPCR在寡核苷酸生物分析中的应用。

[1] Bioanalysis (2016) 8(2), 143–155

[2] Bioanalysis (2019) 11(21), 1967–1981

[3] Bioanalysis (2019) 11(21), 1941–1954

药明康德测试事业部生物分析一站式服务平台旨在为全球客户提供全面的，专业的生物分析解决方案。药明康德生物分析部恪守全球最高质量监管标准，是符合GLP法规的检测机构，已多次通过国家药品监督管理局（NMPA）、美国食品药品管理局（FDA）、经济合作与发展组织（OECD）、欧洲药品管理局（EMA）、日本医药品医疗器械综合机构（PMDA）的全面核查。本部门拥有完善的大、小分子分析平台，为客户提供全方位的药物研发生物检测服务，拥有包括寡核苷酸、细胞基因治疗、双特异性抗体等新型药物形态的生物分析能力对于加速全球客户的新药研发进程、助力全球医药行业发展具有非常特殊意义。